生物芯片类检测试剂主要原材料、生产工艺及质量

控制注册技术审查指导原则（报批稿）

一、前言

本指导原则的主要目的是规范申请人对生物芯片类检测试剂的主要原材料研究资料、生产工艺及反应体系研究资料的准备，并对产品质量控制提出指导性技术要求。

本指导原则系对生物芯片类检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围

根据芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分为核酸芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。本指导原则是针对核酸和蛋白为检测靶分子生物芯片的注册技术审查指导原则，其它类型靶分子检测的芯片诊断试剂可参考本指导原则。

三、基本要求

（一）基本原则

1.试剂研制、生产用各种原料、辅料等应制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。

2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

3.生物芯片类试剂在研制时，应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

4.试剂研制、生产过程中所用的物料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

（二）原材料质量控制

1.核酸检测芯片

核酸芯片检测时，从生物样本中提取的核酸可用荧光标记、金标记和酶标记；检测方法包括光谱学方法和化学显色。下面为荧光标记芯片技术指导原则，采用金标记和酶联显色等的生物芯片诊断试剂可参照核酸芯片和蛋白芯片相关部分。

（1）主要生物原料

核酸检测芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探针、标记物等。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定，企业应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，同时，供应商应提供相应的质量保证证明和相应的质检报告，达到生产规定的质量标准。如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

①模板DNA

重组DNA：经测序验证，关键碱基或序列没有错误。1×TE溶解，浓度为100ng/μl以上，-20℃保存。作为阳性参考品时，其稀释度由企业根据产品标准确定。

②dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP）

HPLC纯，PCR级，无DNase、RNase污染，-20℃以下保存。

③引物

生产中的引物原材料为冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。用标准DNA模板扩增，电泳检测，谱带单一，大小正确，与对照引物比较，产物量一致。符合视为合格引物，-20℃以下保存。

④探针（用于阵列制备）

重组DNA, 冻干粉（或1×TE溶解液）：至少满足一个批次的用量，酶切鉴定分析图谱。

PCR产物，冻干粉（或1×TE溶解液）：至少满足一个批次的用量，PCR电泳鉴定图谱。

合成寡核苷酸：PAGE纯或HPLC纯，至少满足一个批次的用量，提供该产品的PAGE电泳分析图谱或HPLC分析图谱。

探针序列的正确性：应用克隆鉴定的标准DNA杂交鉴定或测序鉴定。

纯度和浓度检测：采用电泳方法，电泳图谱没有杂带，目的条带的强度与已知浓度的标准DNA条带进行参比计算其强度。纯度较高的DNA，可用紫外分光光度计进行定量。检验合格后入库，避光、-20℃以下保存。

⑤标记物

含有激发光波长和发射光波长介于280~680nm的所有荧光分子，HPLC纯。

⑥Taq DNA聚合酶

SDS-PAGE 检测，纯度＞95%，具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性。产品-20℃保存。

⑦尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。1U UNG 37℃处理3分钟后，10³拷贝以下含U模板被降解后不能产生扩增产物。产品-20℃保存。

⑧逆转录（RT） 酶

具有逆转录活性，无核酸内切酶活性，-20℃保存。

⑨RT-PCR酶

具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，94℃ 1小时后仍保持50%活性。产品-20℃保存。

⑩缓冲液

各类酶制品所需的反应缓冲液由厂家随酶制品提供，-20℃保存。

（2）主要生物辅料

主要生物辅料包括酶类（蛋白酶、核酸酶等）、核酸提取试剂、鱼精DNA、封闭用蛋白、杂交液等，企业应建立相应的质量标准。主要生物辅料若为企业自己生产（配制），其工艺必须相对稳定，并按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，同时，供应商应提供相应的质量保证证明和相应的质检报告，达到生产规定的质量标准。

（3）主要化学原辅料

化学原材料的质量标准参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质检报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

（4）其他物料

①载玻片

外观：明亮处用肉眼观察无缺刻，无划伤等。规格按设计要求。

激光扫描仪扫描（波长为芯片检测波长）：包被层基本均匀。

②试管、吸头、试剂瓶等

一次性使用，由生产厂家提供质量保证，达到设计要求。

③其他：

包括试剂瓶标签、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量标准。

2.蛋白检测芯片

（1）主要生物原料

与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆杭体、多克隆抗体以及多肽类生物原科。这类原料可用于点膜、标记相关酶、纳米金、光学基团及中和反应用抗原或抗体等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

① 外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

② 纯度和分子量

生物原料经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析；也可用其他适宜的方法，如高效液相法等进行分析。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为5μg；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。

③ 蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其它适宜方法进行检测。

④ 效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

⑤ 功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

（2）主要生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》规定的质量标准要求，并且要适合于企业生产。

建议作以下检验：

① 牛血清或羊血清

外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物

无菌试验：将血清直接37℃放置7天，放在明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，标准为不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀。沉淀溶于0.85%NaCl溶液至1ml，用Lowry法测定蛋白含量不能大于2mg/ml。

② 牛血清白蛋白：

外观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18-26℃时应不大于15分钟。pＨ值应为6.5~7.1。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，其标准为不小于干重的95％。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为不小于总蛋白含量的95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为不小于90%。

③ 酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。

④ 标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

（3）化学原辅料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质检报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

（4）其他物料

①基质

以硝酸纤维素膜为例：孔径符合设计要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛细迁移速度±20％）、尺寸（与标识吻合）

②试剂瓶和干燥剂

由生产厂家提供质量保证，达到规定要求。

③其他：说明书、包装外盒等

应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准，如数量、规格等。

（三）试剂盒各组分的生产

生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、组织芯片和细胞芯片等。生物芯片诊断试剂产品基本可分成二个部分，一部分是芯片，另一部分检测用工作液。如果有配套的检测仪器，还需对仪器及处理软件的应用加以说明。

1.芯片的生产

芯片生产的基本过程包括探针的获取方法，纯化，点样，固定。

（1）探针获取

不同芯片，主要是探针不同，生物芯片的探针主要包括以下几类，其它探针可参考制定相应的技术及质量标准。

① DNA探针的获取

探针的形式包括PCR产物、克隆DNA、人工合成DNA片段等；要求有生产程序和质量指标及检测方法，要进行纯化，有固定的纯化程序。

② 抗原的生产

抗原获得方法包括细胞培养、从生物材料中分离提取、基因工程表达以及合成肽等。基因工程表达产物又分为纯抗原蛋白、融合蛋白等。

③ 抗体

抗体分单克隆抗体和多克隆抗体。抗体制备包括细胞培养，动物腹水，基因工程表达等方式。

④ 细胞和组织

包括细胞或组织类型，固定方法。组织材料包括固定，包埋，切片等。

（2）阵列的排列设计

阵列的排列可以是依次排列、随机排列、对角线排列以及其它排列方式，但设计时需考虑重复次数和对照等因素。

（3）点阵的制作

使用仪器的需要确定型号，程序；手工制作的也应有标准操作程序。

（4）固定：包括固定方式，固定条件等。

应对芯片生产的过程进行相应的质量控制，如点样和固定过程的监控、点样均一性检验等。

2.工作液配制

（1）芯片生产所需试剂，包括细胞培养基，探针制备试剂，阵列制作和固定试剂等。

（2）样品处理试剂，芯片检测靶分子分为核酸和蛋白质。检测核酸的样品处理试剂包括临床取样，DNA提取或RNA提取试剂，逆转录试剂，PCR扩增试剂，核酸标记试剂等；检测蛋白的处理试剂包括取样试剂，蛋白稀释液以及特殊试剂等。

（3）反应液：检测核酸时的反应液包括预杂交液，杂交液，洗脱液等；检测蛋白时，包括封闭液，抗原/抗体反应液，洗脱液，显色液，显色终止液等。

3.数据判读

（1）判断标准及依据，包括Cut off值的确定依据。

（2）数据判读方式：人工还是软件判读。

（3）如果是软件判读，应提供软件判断的科学依据（包括生物学原理、数据获取原理和判断实验是否成立的依据）以及实验测试的原始报告（或数据），并需要说明：

①软件的来源：购买或自己编制，是否获得注册等。

②软件的用途：包括对数据的分析、存储、解读、含义等。

③软件的使用：基本的使用程序。

(四)半成品质量控制

1.抽样

检验人员按批号抽取检验需要数量的半成品，作好标记，待检。

2.半成品检验

利用上一批检验合格的试剂盒的相应组分，对本批生产出的各种试剂盒组分分别进行检验，检验结果达到产品的质量标准。

半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品进行。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检测所抽样的半成品试剂盒的性能，包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应质量标准的要求。精密性用比最低检测限高一个数量级的质控品，重复检测10次，判定结果一致。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和校准品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性测试。稳定性试验可在在特定温度或特定条件下完成。对蛋白芯片，应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

(五)成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批生物芯片类诊断试剂报批批量不少于2000人份。

1.成品检验

一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品进行。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

2.稳定性试验

试剂批放行前，应完成稳定性试验。稳定性试验可在特定温度或特定条件下完成。对蛋白芯片，每批试剂批放行前，应完成37℃热稳定性试验，达到相应的质量标准。

四、名词解释

生物芯片类检测试剂：本指导原则所定义的生物芯片检测试剂是指将多个生物探针（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗体，组织，细胞等）按预先设计的排列方式固定在特制的基质（包括玻璃片，尼龙膜，硝酸纤维素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并进行标记，然后与固定在基质上的生物探针特异性的结合，再用相应的检测设备（如激光扫描仪、CCD检测仪等）和分析方法（包括软件）进行检测、记录、分析，实现对生物靶分子的定性或定量检测的试剂。

五、参考文献

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社